研 究 概 述

    

    

       人脑类器官在发育生物学、药物研发以及再生医学领域展现出极具前景的应用潜力。然而，现有脑类器官普遍缺乏功能性血管网络，物质输送与代谢废物清除能力不足，易出现内部缺氧、细胞应激及坏死问题，导致模型异质性高、可重复性与成熟度欠佳，极大限制了其应用前景。
      为解决这一瓶颈，美国印第安纳大学研究团队开发出一种3D打印血管仿生可扩散（VID）支架，该支架的网状通道结构可实现物质的动力学扩散，以此构建出几乎无缺氧无坏死区域的工程化中脑类器官（ENOs）。该突破性成果已于2025年5月发表在Cell Stem Cell（IF 20.4）上。与传统中脑类器官（CNOs）相比，ENOs在中脑特异基因的表达、氧代谢水平、神经元成熟度及神经网络电活动等方面均更接近体内生理状态。
       研究团队进一步利用Maestro MEA微电极阵列系统，在电生理功能上，系统地比较了这两类类器官对于药物的响应能力。结果显示，ENOs神经元成熟度更高，神经电活动及网络功能更完善；同时可更灵敏地反映药物对神经网络功能的调控，从而精准地重现生理状态下的药效响应。
      总之，该研究为构建高性能脑类器官模型、解析神经疾病机制及开展药物高通量筛选，提供了一种高效、可靠的全新技术平台。

 

MEA电生理功能验证
 

 

     

I.  ENOs的电活动及神经网络功能更完善

     研究团队利用Maestro MEA系统（Axion BioSystems），在培养第 90 天时对ENOs与CNOs的神经功能进行了表征与比较。ENOs依托内部VID支架优异的物质扩散性能，可持续获取充足氧气与营养，有效维持高耗能神经网络活动的正常运转。反观传统CNOs因物质扩散能力有限，电极接触区域易形成坏死核心，进而导致局部电活动缺失（图5A）。
      MEA检测结果显示，ENOs 与CNOs 均可产生自发放电与周期性网络簇放电活动，符合多巴胺能神经元的放电特征。两者相比，ENOs的电活动分布均匀、信号强度更高，网络簇放电更多（图5B）。 ENOs的活跃电极数量（42.5 vs 24.3）、簇放电频率（0.52 vs 0.21 Hz）以及平均放电频率（3.12 vs 1.05 Hz）均大幅领先（图 5C）。这些数据证实ENOs的神经电活动显著优于CNOs。
       功能连接分析表明，ENOs可形成结构完整、疏密有度的神经网络，兼具丰富的短程与长程电极连接（图5B）；同时，ENOs的平均聚类系数、局部/全局效率、网络密度等核心网络功能指标也显著增加（图 5C）。这表明ENOs的神经网络功能更加完善。而CNOs神经网络稀疏，长程连接大幅减少（图5A），坏死核心是造成网络结构缺陷的主要原因。
      综上，VID仿生血管支架可有效解决传统类器官物质扩散受限、局部坏死、神经功能不成熟等问题，显著提升中脑类器官的电活动能力与神经网络功能完整性。

 

                    
图5. 神经电活动及功能网络得到优化

A）CNOs第90天的MEA检测结果:  CNOs有坏死核心，光栅图和活动热图显示其神经电活动较低，功能连接图谱显示其神经网络稀疏，长程连接少。

B）ENOs第90天的MEA检测结果：VID 支架增强了物质扩散能力，可维持ENOs在 MEA 上的存活与功能，表现出良好的神经电活性，以及疏密有度的神经网络连接。

在功能连接图谱中，连线的颜色与粗细代表电极之间的相关程度，节点的大小则表示与该电极相连的连线数量。

C）第 90 天时ENOs和CNOs的活性电极数量、平均放电频率及网络指标（功能网络的效率、密度与聚类系数）定量分析（平均值 ± 标准误，t 检验，*p < 0.05，n=11，来自 3 次独立实验）。

D）从ENOs和CNOs的单个通道（锋电位幅值最高通道）检测到的代表性锋电位。实线为平均锋电位（叠加 30 个锋电位），阴影范围为标准误。

E）锋电位幅值定量分析（平均值 ± 标准误，t 检验，*p < 0.05，n=8，来自 3 次独立实验）。

 

 

II. ENOs药效响应更优   

       基于 MEA 的类器官电生理检测是神经药物高通量筛选的重要手段。本研究选取临床镇痛药芬太尼开展急性药物干预实验，通过对比药物处理前后的电生理特征变化，来评估ENOs与传统CNOs的药效响应差异。
       结果显示，50 nM 芬太尼处理可显著抑制ENOs的自发电活动，表现为spikes、bursts数量减少（图 6B），平均放电频率、簇放电频率、活跃电极数量均显著下调（图6C）；同时也导致ENOs的神经网络同步性丧失（图S6C）。而同等处理条件下的CNOs未出现明显的神经网络活动丢失，未产生显著药效响应（图6A与图 S6C）。这表明ENOs内部的VID仿生血管支架不仅可以改善类器官神经功能，还凭借优异的物质扩散性能有效突破了传统模型的药物递送瓶颈。
       以上研究表明，相较于传统CNOs（易有缺氧坏死核心、药物渗透效率低下）， ENOs具备更接近生理状态下的药物响应能力，能够真实、灵敏地捕捉药物对神经网络功能的调控效应，为神经药物的功能学高通量筛选提供了优质、可靠的新型类器官研究平台。

 

图6.  药效响应增强

A）CNOs在培养第 90 天，50nM 芬太尼处理前、处理 20 分钟后的光栅图和热图。

B）ENOs在培养第 90 天，50nM 芬太尼处理前、处理 20 分钟后的光栅图和热图。

C）芬太尼处理前后电活动变化的定量分析，指标包括平均放电频率、簇发放频率及活性电极数量（平均值 ± 标准误，t 检验，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.005，n = 11，来自 3 次独立实验）。

图S6C. 药效响应的进一步特征分析

C）ENO与CNO在培养第 90 天，分别于芬太尼处理前、处理 20 分钟后及洗脱后的功能连接图谱，网络密度与全局效率定量分析结果。

MEA实验流程

 

1.   类器官种板

     提前对6孔MEA板（Axion BioSystems 公司）进行两步包被处理，先用浓度 0.05% 的聚乙烯亚胺（PEI）包被 1 小时，随后用去离子水冲洗 3 次；再用溶于 BrainPhys 培养基、浓度为 10 mg/mL 的层粘连蛋白进行二次包被，时长 1 小时。将ENOs与CNOs类器官接种于包被好的MEA板中，每孔放一个类器官，加入少量培养基静置 30 分钟，使其充分贴附；之后向每孔补加 1 毫升 BrainPhys 培养基。类器官贴附完成后，每两日进行半换液。种板4周后开始检测放电活动。

 

2.   自发放电活动记录与分析

     更换培养基 2~6 小时后，采用 Maestro Edge MEA系统及配套的 Axis Navigator 3.5.1 软件（Axion BioSystems），对类器官的自发放电活动进行采集。采集时选用软件默认的Spontaneous配置参数，通过“自适应阈值法（6XSTD）”识别动作电位spikes。将接种有类器官的MEA板放入设备中静置 5 分钟，待环境稳定后再开始记录。原始数据借助 Axis Navigator 软件完成预处理，检出的spikes数据用于后续分析，统计活跃电极数量、平均放电率及簇发放频率等。使用Axion BioSystems 的NeuralMetricTool软件绘制光栅图。
 

3.   功能连接分析

      基于 Elephant Python 工具包计算 spike time tiling coefficient（STTC），同步时间窗设置为 30 毫秒。通过计算各通道神经放电活动的STTC，评估类器官神经网络的功能连接特性；该指标受样本放电率的影响较小。对得到的相关矩阵设定 0.3 作为阈值，以此剔除大部分随机相关信号。结合电极实际排布位置，使用 Matplotlib 与 Plotly 工具包绘制并可视化功能连接图谱。再借助 Networkx 工具包对功能连接进行量化分析，评价指标包括网络效率、聚类系数及网络密度。

   

 

 

 

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