微电极阵列（MEA）电生理功能验证

 

 

I.  iAssembloids 中神经元的电生理活性高于2D单层神经元

研究团队首先通过单核 RNA 测序（snRNA-seq）鉴定了 iAssembloids 中的细胞类型，主要包含神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞，且这些细胞在分化全程维持其固有表型特征。其中，神经元主要表达兴奋性标志物（SLC17A7、SLC17A6），而非抑制性标志物。与2D单层神经元相比，iAssembloids 中神经元的神经元活性相关基因（如谷氨酸受体亚基基因）表达水平更高，据此推测iAssembloids 中神经元的活性可能高于2D单层神经元。

因此，团队进一步借助Maestro MEA系统（Axion BioSystems），分析并比较这两种培养条件下神经元的电生理活性。培养 2 周后，iAssembloids 中神经元的平均放电数量较 2D 单层神经元高出 10 倍，反映出iAssembloids中神经元比2D单层神经元在功能上更成熟（图2D&E）。

此外，研究团队还构建了不同3D培养物（神经-胶质细胞比例不同），其中3D Neurons（3D单一培养神经元）的放电次数最多，电活动最强；而随着星形胶质细胞比例的增加，神经元放电次数逐渐减少，提示星形胶质细胞在缓冲神经元过度兴奋中发挥重要作用（图2E）。同时发现，iAssembloids中星形胶质细胞的存在，可部分降低神经元的电活动与活性氧（ROS）水平。通过CRISPRi筛选发现，GSK3B 敲低会减弱GSK3β 激酶活性及其对保护性NRF2通路的抑制作用，进而提高iAssembloids中神经元的存活率。

 

图7.  F）对与 APOE-ε3  和 APOE-ε4 星形胶质细胞共培养的神经元进行MEA分析

MEA实验流程

1.   iAssembloids 培养与检测

分别使用 Cytoview-6 孔（Axion BioSystems，货号 M384-tMEA-6B）和 Cytoview-24 孔MEA板（Axion BioSystems，货号 M384-tMEA-24W），依次用 0.01% 多聚鸟氨酸、1 μg/mL 纤连蛋白及 5 μg/mL 层粘连蛋白包被，以促进 iAssembloids 贴壁。在显微镜下将 iAssembloids 放置于孔内电极区域。接种前 24 小时，将 iAssembloids 置于 BrainPhys^® 神经元培养基（StemCell Technologies，货号 05790）中平衡，以便与2D单层神经元进行对比。采用 Maestro Edge MEA系统（Axion BioSystems），使用Axion配套软件 “Neural” 默认设置采集数据。

2.   2D单层神经元培养与检测

Cytoview-24 孔MEA板（货号同上）使用 0.1% PEI（Millipore Sigma，货号 03880）进行包被；PEI 溶于 1× 硼酸盐缓冲液（10 mM 硼酸、2.5 mM 四硼酸钠、7.5 mM 氯化钠，pH 8.4），37 ℃ 包被过夜，随后用无菌水清洗并室温晾干。将15 μg/mL 层粘连蛋白加入BrainPhys^® 培养基，于分化第 0 天以 2×10⁵个细胞 / 孔的密度接种细胞。培养 14 天后，采用 Maestro Edge MEA系统（Axion BioSystems），使用Axion配套软件 “Neural” 默认设置采集数据，连续采集 3 次，每次 5 min。

3.   MEA数据分析

采用 Axion BioSystems 配套软件的默认设置进行 MEA 数据分析。动作电位（spike）检测采用自适应阈值交叉法及默认参数，并启用网络簇爆发检测相关设置。随后将.spk格式文件导入 Axion Neural Metrics Tool 软件，截取总时长中 120 s的数据片段绘制光栅图。