肝细胞癌（HCC）是全球第三大癌症相关死亡原因，切除术后复发率约 70%。准确预测 HCC 复发风险意义重大，但现有预后评估工具，如分子生物标志物，在预测 HCC 复发上存在不足，原因之一是未充分考虑肿瘤微环境（TME）的空间异质性和相互作用。研究发现，HCC 的肿瘤微环境空间异质性显著，不同区域的免疫细胞组成不同，肿瘤内 NK 细胞活性和浸润增加与患者生存结局改善有关，但 NK 细胞精确空间分布及对预后的潜在影响研究不足。
中国科学技术大学及其附属医院肝胆胰外科团队，通过观察 61 名患者肿瘤浸润前沿和 NK 细胞的空间分布，开发出肿瘤免疫微环境空间（TIMES）评分系统预测 HCC 复发风险。该系统在 5 个中心队列的 231 名患者中得到验证，准确率达 82.2%，特异性为 85.7%，为早期 HCC 治疗决策提供重要参考。该研究结果于 2025 年 1 月发表于Nature 期刊。
Fig 4c，HepG2和NK92细胞的3D生物打印原理图
为了观察肿瘤浸润前沿和NK细胞的空间分布情况，研究者构建了特殊的3D打印模型。首先，研究者制备了用 PKH67预染色的肝癌细胞系HepG2 单细胞悬液，以及用 PKH62 预染色的NK92 单细胞悬液，并将其置于冰上保存。接着使用生物 3D 打印机（BP8600，EFL）按预设条件打印内外圈模型，内圈含 HepG2 细胞代表肿瘤区域，外圈含 NK92 细胞代表免疫区域。最后将打印好的3D模型在CO2培养箱中孵育，并使用 Lux3 FL活细胞成像系统（Axion BioSystems）追踪细胞的运动情况。以每 30 分钟一帧的频率，对细胞进行为期 5 天的追踪。最后，借助 ImageJ 软件的 TrackMate分析插件，对细胞迁移情况进行分析。
NK92OE-SPON2组动态视频：SPON2过表达组促进了 NK92 （红色）向HepG2（绿色）的迁移。
NK92KD-SPON2组动态视频：SPON2敲低组阻碍了 NK92 (红色）向HepG2（绿色）的迁移。
NK92EV对照组：NK92 细胞（红色）向HepG2（绿色）迁移的动态视频。
从3D打印的HCC肿瘤模型中可以看到，SPON2有助于NK细胞的迁移及其对肿瘤细胞的细胞毒性作用。NK92OE-SPON2（SPON2过表达组）促进了 NK92 细胞的浸润，而NK92KD-SPON2（SPON2敲低组）则阻碍了NK92细胞向HepG2的迁移。Lux3 FL能将整个时间段获得的图片自动合成延时影像（如上述视频），有助于研究者了解整个动态迁移过程。
Fig 4e, 使用Lux3 FL 对NK92EV, NK92OE-SPON2 and NK92KD-SPON2（红色荧光） 向HepG2细胞（绿色荧光）迁移的延时影像。白色圆圈显示了浸润到肿瘤区域的NK92细胞。4g, NK92EV, NK92OE-SPON2and NK92KD-SPON2细胞向HepG2细胞的迁移速度。
研究者借助 ImageJ 软件的 TrackMate分析插件，对NK细胞的迁移速度进行了定量统计，结果如图4g所示，与动态视频的结论一致。（编者按：Lux3 FL还具备细胞汇合度、荧光计数、划痕等分析功能，适用于细胞增殖、转染、凋亡、细胞杀伤、划痕等实验。）
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