研究概述

心肌梗死造成心肌细胞不可逆损伤，常会引发心力衰竭。虽然人多能干细胞衍生的心肌细胞（hPSC-CMs）移植为心脏再生带来了新希望，但移植后容易出现植入性心律失常（EA，表现为短暂的严重室性心动过速），阻碍了其临床应用。

研究指出，hPSC-CMs不成熟的电生理特性是引发EA的关键。这些细胞的离子通道表达类似胎儿心肌细胞，富含起搏相关通道（如HCN4、CACNA1H），但缺乏成人心肌细胞中的超极化通道（如KCNJ2），因此自发去极化能力较强。通过基因编辑调控离子通道表达，降低hPSC-CMs的自动节律性，有望解决EA问题，推动心脏再生技术的临床应用。

在本文中，美国华盛顿大学的研究团队首先分析了hPSC-CMs在体内成熟过程中离子通道基因的表达模式。在此基础上，他们利用药理学和基因编辑技术，在体外鉴定出调控心肌细胞自动节律性的关键离子通道。通过一系列实验，团队最终确定了一种多基因修饰策略：敲除HCN4、CACNA1H和SLC8A1基因，并在HCN4启动子的调控下敲入KCNJ2基因，成功培育出转基因心肌细胞（MEDUSA）。实验结果显示，MEDUSA细胞在静息状态下无自发电活动，但在电刺激下仍能产生收缩反应。最终的猪模型移植实验表明，植入的MEDUSA细胞能够与宿主心肌细胞形成良好的电-机械耦合，并且不会引发持续性心律失常，显著降低了术后死亡率。

综上所述，本研究在体内和体外实验中，都证实了上述基因编辑策略可有效提升hPSC-CMs移植的安全性，为解决心肌细胞疗法中的一个关键问题——植入性心律失常提供了新的解决方案，对于提高心肌细胞疗法的安全性和有效性具有重要意义。这些成果于2023年4月发表在Cell Stem Cell（IF 19.8）上。

在本研究中，MEA实验为找到细胞机制的关键研究靶标提供了重要的佐证，并在生理功能上证实了基因编辑的效果，打通了细胞功能表型和分子机制之间的认知鸿沟，也为后续的动物活体实验夯实了研究基础，大大降低了研究的时间和物质成本。

MEA检测结果

编者按：鉴于hPSC-CMs的电生理特性可能因具体分化方案和/或细胞群体的异质性而有所不同，文中基因修饰及电生理功能验证等实验使用的细胞均是hESC-CMs (具有更稳定的遗传背景和分化特性，适合基因编辑后的功能验证)。

验证离子通道调控自动节律性的作用机制

为了明确 hESC-CMs 自动节律性的驱动因素，研究者使用Maestro MEA平台测试了多种药理化合物对hESC-CMs搏动的影响，测试结果如下：

Fig 2S

(A, B) 不同浓度Ivabradine和Zacopride作用于hESC-CMs的剂量-效应曲线。横轴：药物剂量的对数值；纵轴：处理组相对于对照组（DMSO）的心率变化百分比。数据来自2次独立实验，每次实验有6个生物学重复计算均值±标准误（SEM）。数据以基线值进行归一化处理，曲线表示归一化反应的非线性回归。

药物名称	作用靶点	MEA检测结果
Ivabradine	If通道（HCN4/If）	hESC-CMs 搏动频率下降，但自发动作电位仍会发放（图 S2A）
Zacopride	Kir2.1 通道(KCNJ2/IK1)	hESC-CMs 搏动频率无显著影响（图 S2B）

Fig 2S

C-F: ML218、Mibefradil、Verapamil、SEA0400和KBR7943作用于hESC-CMs博动频率（左y轴）和振幅（右y轴）的剂量-效应曲线。横轴：药物剂量的对数值；纵轴：处理组相对于对照组（DMSO）的心率/振幅变化百分比。（数据来自2次独立实验，每次实验有6个生物学重复计算均值±标准误（SEM）。数据以基线值进行归一化处理，曲线表示归一化反应的非线性回归。）

药物名称	作用靶点	MEA检测结果
ML-218	T型钙通道（ICaT）	高浓度时显著降低 hESC-CMs 的搏动频率（图 S2C）
Mibefradil	T型钙通道（ICaT）	搏动频率呈剂量依赖性降低；较高浓度时还会降低动作电位幅度（图 S2D）
Verapamil	L 型钙通道（ICaL）	搏动频率和动作电位幅度都显著且逐渐降低（图 S2E）
SEA0400 & KB-R3702	钠钙交换体 NCX1	频率和动作电位幅度呈剂量依赖性显著降低（图 S2F）

检测结果表明，Ivabradine和Zacopride两种药物对心率的影响不大。ML-218和Mibefradil在高浓度下都降低了 hESC-CM 搏动频率，推测两种药物可能阻断了T型钙通道（ICaT），为 ICaT 参与自动节律性提供了直接证据。再加上三种钙通道抑制剂Verapamil 、 SEA0400 和 KB-R3702 均能够以浓度依赖的方式降低hESC-CMs心率和动作电位振幅，突显出钙离子转运在 hESC-CM 自动节律性中的重要性。

靶向调控自动节律性离子通道基因

研究团队通过CRISPR/Cas9技术靶向调控与心肌细胞自发电活动相关的离子通道基因。他们从单基因修饰入手，根据Maestro MEA及钙成像和膜片钳等检测结果，逐步尝试改进基因修饰策略。最终发现自发性节律由HCN4（I_f）、CACNA1H（I_CaT）和SLC8A1（NCX1）共同驱动，单一基因编辑无法完全消除电活动。因此，他们通过阻断电压钟（HCN4/CACNA1H）和钙钟（SLC8A1），同时增强超极化（KCNJ2）的方式，得到了具备静默且可兴奋表型的心肌细胞。

利用Maestro MEA对基因修饰后的样本进行电生理功能检测，结果总结如下：

Fig.2

D&E: 对照及HCN4敲除组在MEA系统上自发搏动心率及振幅变化百分比柱形图。

F: 对照及HCN4/CACNA1H敲除组在MEA系统上自发搏动心率变化百分比柱形图。

数据以2或3次独立实验的平均值±标准误（SEM）表示，每次实验包含8次生物学重复。通过单因素方差分析（one-way ANOVA）及Sidak多重比较校正（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

修饰策略	基因名称	检测结果
单基因编辑	HCN4敲除	搏动频率降低50%，但未消除自动性（图2 D&E）
单基因编辑	CACNA1H敲除	单独敲除对频率无显著影响（图2F 橙色和黄色柱形图）
双基因编辑	联合敲除HCN4/CACNA1H	相较于单独敲除CACNA1H，细胞搏动频率进一步降低（图 2F 绿色和蓝色柱形图），但仍存在不规则电活动。

Fig.3D

左图和中图分别是每分钟平均搏动次数和相应的搏动不规律性百分比柱形图。搏动不规律性百分比：100秒内搏动周期标准差与搏动周期平均值之比值。数据以3次独立实验的平均值±标准误（SEM）的形式绘制，n=8。红色：野生型；蓝和紫红色：两个基因修饰组；绿色：绿色荧光蛋白对照组。

修饰策略	基因名称	检测结果
双基因编辑	敲除HCN4和条件性过表达KCNJ2	基因修饰导致样本搏动不规则性增加，且这些短促的搏动被长时间的静止期所间隔（图 3D）

Fig.4

F: 横轴：心肌细胞分化时间，纵轴：有搏动的孔占所有检测孔之百分比。（n=12）。

G: 心肌细胞在MEA平板上培养至Day28和Day35的代表性场电位波形图及每分钟搏动次数柱形图。数据展示为5分钟内记录的平均每分钟搏动次数±标准误（SEM），来自3次独立实验，每次4个重复。

修饰策略	基因名称	检测结果
单基因编辑	SLC8A1敲除	在分化过程中搏动起始的时间与野生型（WT）没有差异，但在分化过程中表现出间歇性的静止期。（Fig. 4F 红色&绿色线条）
三重基因编辑	SLC8A1/HCN4 KO + KCNJ2 KI	自发活动几乎消失（<5次/小时），仅在应激时偶发跳动（Fig. 4F 黄&蓝线条，Figure 4G）

Fig.5

B: 横轴：细胞分化时间；左纵轴：有搏动的孔占所有检测孔之百分比；右纵轴：心率（bpm）。数据以平均值±标准误（SEM）表示，来自2次独立实验。

C：第25、28和35天5min内心肌细胞搏动次数对比，结果显示MEDUSA hESC-CMs在5min内搏动次数不足1次。第35天在20h内搏动次数约为6次。

修饰策略

基因名称

检测结果

四重基因编辑

HCN4/CACNA1H/SLC8A1 KO + KCNJ2 KI

MEDUSA基础状态下无自发电活动，仅在细胞处于应激条件下（例如乳酸刺激Fig. 5B）才会偶尔出现搏动。

持续观察至分化后第25、28和35天，MEDUSA自发电活动也是呈现极少（＜5 beats/hour）状态，这表明这些细胞比野生型（WT）和其他迄今为止测试的细胞系更加静止。

MEA检测实验条件

MEA系统准备：使用0.17 mg/mL的Matrigel在37°C下预处理1小时CytoView MEA 48孔板。每孔接种50,000个hESC-CMs，培养基使用RPMI 1640+B27，每两天更换一次培养基。
自发性电活动记录：在单层心肌细胞接种到MEA板以后，根据实验需要在分化过程中持续监测MEA板上心肌细胞电活动。使用Maestro Pro系统在37°C、5% CO₂条件下记录5分钟的自发性电活动用于数据分析。对于携带KCNJ2基因（KI）的细胞系，由于其搏动节律不规律，以每次实验记录的总搏动次数除以记录总时间（平均搏动频率/分钟）计算其心率。
药物处理：不同的药物在DMSO中稀释后，直接加入MEA孔中孵育5分钟。药物对自发性搏动频率的影响通过药物孵育后15分钟的记录数据来评估。使用非线性回归曲线（Y = 100 / (1 + 10^(LogIC50-X) * HillSlope)）来计算药物的剂量-反应关系。
电活动监测：所有电极同时采集，采样频率为12.5 kHz，使用2kHz的低通数字滤波器进行噪声抑制。
搏动频率、峰值幅度和搏动周期不规则性的量化：使用Axis Navigator软件进行量化分析，设置搏动检测阈值为30-100 μV，最小搏动周期为200-500毫秒，最大搏动周期为30秒。

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