摘要

阻抗实验

 

 

      为了在体外实时评估CAR-T细胞治疗的效果，研究团队收集并制备了6例患者GBOs，借助Axion Maestro Z细胞阻抗平台开展了杀伤测试实验。他们首先将GBO接种到阻抗板，2天后按照1:10效靶比加入患者自身来源双靶点CAR-T细胞继续共培养6天。图1B为各组杀伤效力随时间变化曲线图。结果显示，1-4和6号病人自体CAR-T细胞杀伤效力随时间逐渐增加，最高可接近100%；5号病人仅需30h杀伤效力就达到30%左右。这些数据结合其他方法学检测结果共同反映出，尽管存在个体差异，CAR-T细胞依旧能够不同程度地杀死GBOs中的肿瘤细胞。

Fig 1B 自体CAR-T细胞与GBOs共培养144小时杀伤曲线

蓝色为对照组GBOs，红色为处理组GBOs.数值表示为平均值±标准误（SEM）（所有患者中，对照组n=6，处理组n=12）。

 

      为了验证双靶向CAR-T杀伤的特异性，研究团队还在同期收集了一例未参与该临床试验项目的患者样本（编号UP-11273, 不符合CAR-T细胞输入要求），也分别制备了自体CAR-T细胞和GBOs。他们将该患者的GBOs（Control）与双靶点CAR-T细胞(Treated)、靶向CD19的自体CAR-T细胞（CD19）和自体未修饰（UTD）T细胞分别共培养，也在Maestro Z上开展了阻抗检测，结果如图S2A&B所示。Treated组杀伤效力仅需十几个小时就超过40%，且随时间的推移没有明显降低，而CD19和UTD组杀伤效力始终不足20%。这一结果反映出，双靶点的修饰显著提升了效应细胞的毒性，从而诱导了细胞溶解。后续cCas3的免疫染色实验也证实了这一结论。

Fig S2不同处理的UP-11273患者来源CAR-T细胞对自体来源GBOs杀伤实验

A) 各组杀伤效力随时间变化曲线

B) 第144h各组杀伤效力柱形图

 

阻抗实验方法

1. 依次使用0.1 mg/mL的多聚-D-赖氨酸（Sigma Aldrich）和20 mg/mL的层粘连蛋白（Sigma Aldrich）在37°C下过夜包被CytoView Z 96孔阻抗板。

2. 将类器官（GBOs）接种到阻抗板上，并使用Maestro ZHT平台（Axion Biosystems）连续监测2天，以确保其贴壁生长。

3. 按照1:10的比例添加患者来源CAR-T细胞后，将Cytoview Z阻抗板放回仪器，继续监测6天。(按照1:10效靶比，根据类器官中肿瘤细胞数量估算出需要添加的效应细胞数量)。

4. 由于每个类器官中的肿瘤细胞总数存在差异，因此采用了大量生物重复实验来弥补这一点，每个条件下至少接种12个类器官。

5. 使用AxIS Z软件（Axion Biosystems）持续记录各孔阻抗值。数据分析前所有数据都已根据添加T细胞时的阻抗值进行了校正。

6. Cytolysis百分比的计算使用了未处理组和完全裂解组作为对照来确定各时间点的靶细胞裂解情况。计算公式如下：

   

7. 所有Cytolysis计算均使用AxIS Z软件生成。

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