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研 究 概 述

      石油柴油（以下简称柴油）在不完全燃烧过程中产生的颗粒物(PM)主要由碳质核心、可溶有机组分和少量硫酸盐类物质构成。其中碳质核心可以吸附半挥发性有机化合物和金属等成分，被人体吸入后会加重呼吸道和心血管病情，还会对大脑产生不利影响引发神经退行性疾病。

      生物柴油是以动/植物油脂等生物质为原料制备的长链脂肪酸单烷基酯混合物，是一种环境友好型的可再生燃料，可作为石化柴油的替代品。

      为了比较柴油和生物柴油燃烧产生的可吸入颗粒物（PMDEP和PMBIO）对肺部和大脑的直接及间接毒性，来自荷兰乌得勒支大学的科学家们开展了一系列相关实验。他们的检测结果表明，上述两种颗粒物暴露对体外肺模型均没有造成明显不良影响。团队接着使用了微电极阵列（Maestro MEA）记录和分析了这些颗粒物对体外脑部模型引发的毒性效应。结果显示，两种柴油燃烧产生的可吸入颗粒物在直接接触样本后都能显著抑制神经电生理功能。并且与 PMBIO 相比，PMDEP 表现出更高的神经毒性效力。

      这一研究为风险管理和监管部门提供了重要的毒性数据，以评估用生物柴油替代石油柴油在多大程度上能够降低对人类健康的危害。该研究成果发表于2024年2月《Environment International》（IF 10.3）上。

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MEA 实验结果

      研究者借助被广泛使用的神经毒性检测设备Maestro Pro，来记录评估不同处理条件下神经元的自发网络电活动（Fig1 D）。该设备采用MEA技术，能够以一种非侵入且灵敏的方式获取神经电活动相关的多个参数。在本文中，他们着重分析了平均放电率（MSR）、平均簇放电率（MBR）和平均网络簇放电率（MNBR）三个参数的变化，并以此作为衡量神经毒性的指标。

Fig1 D 使用Maestro MEA记录评估PM神经毒性流程图。

间接暴露神经毒性检测

       除了上述PMDEP和PMBIO两种颗粒物外，研究者还使用了清洁碳燃烧产生的颗粒物CP (其碳质核心吸附的有机物质和金属/水溶性污染物都很低)，来验证碳质核心本身是否也会引起相应的肺部和大脑毒性。

      首先，研究者将体外肺细胞模型暴露于低、中、高三个浓度的三种PM和生理盐水对照（ALI ctrl）处理条件下48h，检测到它们对肺模型均没有产生明显或特异毒性。在此基础上，他们进一步研究了肺部接触PM后对大脑的影响：即收集上述各组肺模型培养基各125ul，加入到375ul大鼠原代皮层神经元培养体系中，在体外模拟肺细胞摄入PM后引发的间接神经毒性效应。图6为Maestro MEA设备采集的处理0.5h、24h和48h后，MSR、MBR和MNBR的变化百分比柱形图。

Fig6 间接暴露处理0.5h、24h和48h大鼠初级皮层细胞的神经元电活动。

以神经元培养基组作为对照，计算各处理组MSR、MBR和MNBR变化百分比。（N=2-3板，n=12-24孔计算标准误±SEM。±30%作为毒理学相关性的基准值，图中以灰色表示。参数变化超出此基准值的处理组计算其差异显著性。）

      与神经元培养基对照组相比，高剂量PMDEP 肺模型培养基处理0.5h可使 MSR 增加58%。中&高剂量 PMBIO 处理0.5h及24h可导致MSR和MNBR增加约40-53%（图 6A&B）。图 6C 48h结果则显示上述各参数的增加作用随着处理时间的延长逐渐降低至与对照组相当的水平，表明大鼠原代神经元电生理功能并没有因长时间暴露于体外肺模型培养基而受到显著影响。

直接暴露神经毒性检测

      PM也可以穿过肺部的气血屏障经由血液循环抵达大脑，因此研究者对直接接触引发的神经毒性也进行了测试。他们将生长在 MEAs 上的大鼠原代皮层培养物直接暴露于1、3.162、10、31.62、100 μg/ml颗粒浓度梯度（假设所有颗粒都会沉积在细胞上），并评估了急性（0.5h）和长期（24h、48h和 120h）暴露后神经元电活动的变化(图 8)。

Fig8 大鼠原代神经元直接暴露于三种PM 0.5h、24h、48h和120h后MSR、MBR和MNBR随PM浓度变化量效曲线。（其中X轴PM浓度依次为1、3.162、10、31.62、100 μg/ml，取log后与Y轴三个参数变化百分比进行曲线作图。）（N=3板，n=18-24孔计算标准误±SEM。灰色区域为毒理学相关性的基准值：0.5h：±20%；24h：±25%；48h：±25%；120h：±35%。参数变化超出此基准值的处理组计算其差异显著性。）

      图8A结果显示，除了100 μg/ml PMDEP会引起 MBR 的适度降低外，其他条件急性暴露都不会影响神经元的电活动。图 8B-D表明在长时间(24h、48h和120h）暴露后，PMDEP 和 PMBIO 都能持续抑制神经元活性，并且它们的最高剂量暴露120h都能够将三个参数降至接近0的水平，表现出较强的神经毒性。有趣的是，10μg/ml PMDEP的暴露处理24h和48h均能够显著降低神经元电活动，而10μg/ml PMBIO处理则未观察到任何影响。31.62μg/ml PMDEP和PMBIO处理组，各参数随时间延长均表现持续下降的趋势。但后者各参数降低的程度小于前者，表明PMDEP具有更高的神经毒性效力。相比之下，各时间点CP的暴露均没有表现出对神经电活动的抑制（图 8B-D），这说明PMDEP和PMBIO的神经毒性是由 PM 表面的衍生化学物质（如金属或脂肪酸甲酯诱导多环芳烃PAH等有机化合物）燃烧引起，而非炭质核心引起的。

      最后，由于颗粒物暴露诱导的毒性与神经炎症密切相关，研究者也设计实验检测了促炎刺激对神经元功能的间接和直接影响。但整体而言，并没有检测到神经元活动参数的显著变化。（详细内容请参阅文章原文）

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MEA实验过程及数据分析

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