微电极阵列（MEA）电生理功能验证

 

 

      为了验证 “中脑MO-后脑HBO组装体” 模型是否具备功能性神经元连接以及信号传导的方向性，研究团队开展了如下实验：

      首先，构建了一套定制化的双腔室微通道装置。该装置通过微通道器件连接两个独立腔室，将健康组MO 与 HBO 分别置于两个独立腔室中。腔室间的微通道与 12 孔 MEA 板的平面电极阵列精准对位（图4C），由此构成 MD-MEA 集成检测系统。

      随后，借助 Maestro MEA 平台对两类类器官的电生理活动进行长期监测与分析。 图4D结果显示，在共培养的前 21 天内，组装体的动作电位（Spike）与平均放电频率（MFR）均呈显著上升趋势，21 天后则逐步下降，表明其电活动随培养时间呈动态波动。接下来，使用AxIS和Matlab软件对采集的信号进行分析。软件通过各通道内各电极所记录到的信号时间对应信息，追溯spike首次被检测到的电极位置，进而判断信号起源于中脑区域或后脑区域（具体分析方法参见文末“MEA实验流程”第4部分）。统计表明，约80%的动作电位及簇放电起源于MO区域，仅约20%来自HBO（图4E）。并且大部分时间段都维持这一趋势，这一结果直接证实MO与HBO之间存在稳定的轴突双向通讯，且信号始发具有明显的区域倾向性。

 

图 6.  H–H和 H–PD组装体传导事件占比统计图

E, F）组装体MD-MEA 记录到的Spike及Burst传导事件（HBO→MO或反方向）占比统计随时间变化图（n=3）。

       上述MEA电生理结果结合逆行病毒示踪及病理分析等多种检测结果共同证实：帕金森病相关的病理性𝛼-Syn可从后脑类器官传播至健康中脑类器官，并首先引发突触功能紊乱与电信号传导方向异常，在体外验证了𝛼-Syn沿脑干自下而上的病理传播假说。

1. 微通道-MEA（MD-MEA）系统构建

       采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）材料制备微通道器件（MD），并精准对位于12孔MEA板（Axion Biosystems，M768‑CL1‑30Pt200）的电极区域。在连接两个类器官的微通道内，沿通道轴向以200 μm间距排列最多8个记录电极。该系统设计旨在引导类器官间轴突沿预定微通道定向生长，并在电学隔离条件下建立稳定、可控的类器官互连微环境。

2. MEA板表面包被

       为促进细胞黏附与生长，MEA板依次进行两步包被处理：首先，使用含0.1 mg/mL多聚赖氨酸（Sigma‑Aldrich, P7886）的PBS溶液于37℃包被过夜；随后，更换为含1 mg/mL层粘连蛋白（Sigma‑Aldrich, L2020）的PBS溶液，继续37℃孵育1小时。孵育结束后移除层粘连蛋白溶液，使用PBS洗涤两次，以去除未结合蛋白，获得适宜细胞黏附的功能化表面。

3. 类器官接种与长期培养

       类器官在96孔超低吸附板中分化培养20天后，转移至预包被的MD‑MEA系统相应腔室中，并辅以少量基质胶（Geltrex）协助固定。类器官在分化培养基中继续培养最长至52天，期间每周进行1‑2次电生理记录。记录时间以分化起始后第20天为基准，表示为体外培养天数（DIV）。整个培养过程在37℃、5% CO₂、静态条件下进行。实验设计中，中脑类器官（MO）始终置于器件左侧腔室，后脑类器官（HBO）置于右侧腔室；MO均来源于健康对照细胞系（ Ctrl_2 细胞系），而HBO则分别采用健康对照与携带三倍体SNCA基因的帕金森病模型细胞系（ 3×SNCA 细胞系）。

4. MEA电生理数据分析

4.1 数据导出与可视化：使用Axis软件导出原始神经电生理记录数据，并借助GraphPad Prism进行统计图表绘制。

4.2 信号预处理：数据采样率为12.5 kHz。为消除基线漂移与高频噪声，采用200 Hz高通与3 kHz低通滤波器进行带宽限定；spike检测阈值设定为高于背景噪声标准差6倍（6XSTD）。随后导出各电极记录的spike与burst的时间序列列表，并导入MATLAB进行后续分析。

4.3 传导速度测定：通过对同一微通道内各电极记录的spike序列进行互相关分析，识别互相关函数峰值所对应的滞后时间，据此计算信号在相邻电极间的传导延迟。结合已知电极间距（200 μm），推导出信号传导速度，其值分布于1.5–2 m/s范围内。该速度值的分布特征反映了微通道内轴突在长度和生理特性上的自然差异，体现了神经元传导属性的内在异质性。

4.4 传导方向判定：采用基于时间窗口的配对电极分析法确定信号传导方向。首先依据互相关分析得到的典型滞后时间设定时间窗口，该窗口对应于信号在相邻电极间传导的预期时间范围。随后，系统筛选两个电极的事件序列，仅保留在首电极事件发生后、于时间窗口内在次电极出现匹配事件的事件对，从而提取具有明确时序关系的传导事件。通过统计从MO传导至HBO以及反向传导的事件数量，并计算占比，推断两类类器官间信号传递的整体方向性与优势传导路径。